Depuis plus de 20 ans, nous archivons nos composés de recherche originaux issus des travaux du laboratoire (plus de 20 000 molécules) dans une chimiothèque. Nous sommes membres de la Chimiothèque Nationale – ChemBioFrance depuis sa création en 2003 sous l’égide du CNRS. La majorité de nos collections sont ouvertes à la collaboration et peuvent être criblées physiquement ou virtuellement.

Le Monolith X de Nanotemper permet des mesures d’interactions ligand-cible rapides, sensibles, peu consommatrices en protéine, et réalisables sur des cibles diverses et difficiles telles que les protéines membranaires. Elle permet l’étude d’interactions protéine-protéine ou la formation de complexes ternaires (PROTAC par exemple). La technique nécessite un marquage fluorescent spécifique de la cible réalisable avec des kits fournis (marquage covalent lysine ou cystéine, ou non-covalent His-Tag ou SNAP-Tag). Les mesures se font en capillaires de 10 µL à des concentrations en protéine basses (typiquement 20 – 100 nM). L’appareil combine deux modes de lecture : spectral shift (changement de la longueur d’onde d’émission provoqué par le binding) et MST (modification des propriétés microthermophorétiques provoquées par le binding).

Pour des besoins ponctuels, nous réalisons des analyses à la demande. Pour des besoins récurrents, nous privilégions l’accès en semi-autonomie, après formation.

La titration calorimétrique isotherme (ITC) est une technique puissante mais exigeante permettant de quantifier n’importe quel phénomène s’accompagnant d’une évolution de chaleur : interaction ligand-cible, complexation, partitionnement, réaction chimique… Dans le cadre des interactions protéine-ligand, l’ITC permet de travailler avec des protéines natives non marquées, sans nécessité de développer un test biologique spécifique, et fournit des données thermodynamiques complètes (K_d, stœchiométrie, enthalpie et entropie de réaction). Les principales limitations restent la consommation élevée de protéine, des expériences longues, et le strict contrôle nécessaire des conditions expérimentales (pureté élevée, buffers exactement identiques).

L’ITC Malvern Microcal PeaQ possède une des plus petites cellules disponibles sur le marché (moins de 300 µL de solution), en hastelloy hautement inerte, et une sensibilité très élevée permettant de travailler à plus faible concentration.  Nous proposons l’étude d’interactions ligand-protéine, molécule-membrane ou tout autre cas de figure sur demande.

Pour des besoins ponctuels, nous réalisons des analyses à la demande. Pour des besoins récurrents, nous privilégions l’accès en semi-autonomie, après formation. La maitrise de l’ITC prend du temps, et la formation initiale nécessite plusieurs jours entiers de présence sur place.

Les technologies Alphascreen® et AlphaLISA® sont principalement utilisées sur la plateforme pour mettre en évidence des interactions protéine-protéine (évaluation de PROTAC, cascades de protéines apoptotiques). D’autres cibles peuvent être explorées sous réserve de disponibilité des kits de billes. Les deux cibles sont fixées à des billes donneuses et acceptrices, qui en cas de rapprochement physique émettent un signal par chémoluminescence via la production d’oxygène singulet.

Ces tests ont l’avantage de se dérouler en plaque 96 puits, leur préparation fait donc appel à des techniques conventionnelles.

Filtres fluorescence : excitation 540/25, 530/25, 360/40 ; émission 460/40, 528/20, 620/40, 590/35.

Blocs miroir pour HTRF : Top 400 (dichroique ½, ex 200-395, em 405-850), Top 570 (dichroique full ou ½, ex 200-565, em 575-850), Top 510 (dichroic full ex 400-505, em 515-640).

Le Sirius T3 de la société Pion Inc. est un système de titration acide-base miniaturisé et semi-automatisé permettant de déterminer avec une haute précision et reproductibilité des paramètres utiles de pharmacopotentialité pour des produits ionisables : pKa, lipophilie, solubilité aqueuse. Moins connues que les techniques en flacon agité, les déterminations pH-métriques ont l’avantage, pour des produits ionisables, d’offrir des données de qualité similaire voire supérieure, notamment pour la mesure de solubilité, dans un temps expérimental réduit et avec une meilleure reproductibilité. Une seule expérience permet de produire des profils complets sur toute la plage de pH usuelle (plus besoin de mesurer des logD à plusieurs pH par exemple). L’automate Sirius T3 permet de travailler sur quantités réduites (moins de 10 mg pour une caractérisation complète) à un débit amélioré par l’automatisation, pour produire des paramètres de physico-chimie de grande qualité sur des composés pré-sélectionnés : hits, leads, produits de référence. Pour explorer des collections plus vastes ou des produits non-ionisables, nous proposons d’autres techniques.

Chaîne UHPLC Agilent 1290 Infinity II avec pompe binaire 1300 bar, injecteur automatique Vialsampler, thermostat multi-colonnes et détecteur UV à barrette de diodes (série 1260). Nous utilisons des colonnes diverses (C18, aromatique, polymère, exclusion stérique de protéines…). La chaîne est utilisée pour la quantification (dosage de solutions, de formulations etc), la détermination chromatographique de logP/logD, et toute application ponctuelle.

Nous développons et employons des méthodes de mesure de logP/logD_7.4 plus élaborée que les index chromatographiques gradient largement répandus dans l’industrie. Au prix d’un léger surcroit de travail expérimental, nous pouvons déterminer des logP/logD_7.4 avec une très bonne précision et à un débit allant jusqu’à 50 molécules par jour (fonctionnement par campagnes). L’appareil est également accessible en interne et aux collaborateurs directs du laboratoire.

Le test parallélisé de perméabilité à travers les membranes artificielles permet de mimer simplement les barrières biologiques à franchir pour permettre l’absorption gastrointestinale (PAMPA-GIT) ou à travers la barrière hématoencéphalique (PAMPA-BBB). Il utilise des plaques « sandwich » 96 puits séparées par un filtre imbibé de lipides et mesure la diffusion passive des composés du compartiment donneur au compartiment accepteur du sandwich, à travers la membrane artificielle. De nombreuses configurations sont possibles. Notre laboratoire utilise la méthodologie “double sink” mise au point par le laboratoire Pion Inc., offrant une simulation plus réaliste des fluides gastriques et sanguins, ainsi que des membranes.

La solubilité doit être suffisante (30 µM environ) et devrait être vérifiée avant évaluation. De plus, une évaluation préalable de la lipophilie est également souhaitable, les molécules très lipophiles étant largement retenues par les membranes PAMPA, ce qui influence grandement le résultat.

Aimant 400 MHz Bruker Ascend Evo équipé d’une console NanoBay AvanceNeo, d’une sonde deux canaux large bande iProbe BBFO ¹H/¹⁹F/³¹P-¹⁰⁷Ag, d’un thermostat BCU II permettant de travailler de -40°C à +80°C. Analyses rapides en journée, analyses longues et caractérisations complètes la nuit et le week-end.

Chaîne HPLC-MS basse résolution utilisée en routine pour la chimie organique. Pompe quaternaire, injecteur automatique 125 positions, thermostat à colonnes, détecteur UV à barrette de diodes et détecteur masse simple quadrupôle.

Spectromètre de masse à haute résolution avec ionisation MALDI (désorption-ionisation sur matrice assistée par laser), particulièrement adaptée aux poids moléculaires élevés : macromolécules, peptides, protéines intactes ou fractionnées, acides nucléiques, polymères… Il peut être utilisé pour caractériser des produits purs ou en mélange, y compris dans des matrices biologiques complexes, objectiver la modification covalente de protéines, déterminer des poids moléculaires moyens de polymères etc. La détection se fait par temps de vol simple, avec ou sans réflectron.